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如何快速鉴定 RNA 结果?

发布时间:2019-03-21 10:48 |  点击次数:

提取理想的 RNA 在分子生物学领域所用的众多实验技术中是必不可少的。有很多技术可以用于基因表达分析,对于这些技术而言,分离得到完整的 RNA 是必不可少的一步。Northern 分析,荧光定量 PCR 以及用于微阵列芯片分析的 cDNA 标记实验(尤其在使用 oligo(dT)作为引物时)均要求 RNA 具有高度的完整性。而 RT-PCR 与核糖核酸酶保护实验均涉及到对较短序列区域的分析(通常短于 1kb),因此较易接受部分降解的 RNA。

无论下游具体实验是做什么,进行基因表达分析之前检测 RNA 的完整性都是有意义的。

常见检测方法 

1)琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 样品是否有降解以及杂质。

2)NanoDrop 2000 分光光度计检测样品纯度。 




琼脂糖凝胶电泳 

RNA 琼脂糖凝胶电泳图主要需查看以下几方面:
1)目的条带是否明亮清晰;
2)泳道内是否有降解弥散区;
3)胶孔处是否有蛋白质的污染;
4)是否有 DNA 污染;

完整的总 RNA 在琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的 28S 和 18S rRNA 条带(真核样品),泳道无弥散区, 无蛋白和 DNA 污染。28S rRNA 条带的强度应当大致为 18S rRNA 条带的两倍,这种 2:1 的比率(28S:18S)是判断 RNA 完整性的一个很好的指标(图一,第 2、3 条泳道,思科捷货号:AC0307 提取);如果 RNA 的 28S:18S 比值<2:1,表明提取过程部分 RNA 降解,电泳条带会弥散,没有清晰的 rRNA 条带(图二,第 2、3 泳道);如果点样孔下方有条带,可能提取的 RNA 有蛋白质污染(图三,第 2 泳道);如果点样空和 28S 中间有一条明显条带,说明 RNA 提取过程可能有 DNA 的污染(图四,第 2、3 泳道)。

(从左往右,依次为图一、图二、图三、图四)

货号:AC0307,样本:玉米种子 


分光光度法 

OD260/OD230 与 OD260/OD280 均可用于判断 RNA 提取纯度,分别表示 RNA 样品中有无碳水化合物和蛋白质污染。实验室一般习惯用 OD260/OD280 值初步鉴定核酸提取的纯度。
A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,如酚,糖类等;A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长,如 RNA,DNA,引物等;A280nm 是蛋白质最高吸收峰的吸收波长。

1)OD260/280

1.1.7 <OD260/280<2.0 —— RNA 提取较纯。

1.OD260/280<1.7 —— RNA 提取过程可能有蛋白质或酚污染。

1.OD260/280>2.0 —— RNA 提取过程可能有异硫*酸残存。

2)OD260/230

1.OD260/230 ≈ 2.5 —— RNA 提取较纯

1.OD260/230<2.0 —— RNA 提取过程被碳水化合物(糖类),盐类或有机溶剂污染。

NanoDrop 2000 微量分光光度计


了解以上信息,看懂 RNA 检测报告就是小 case 了。

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