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琼脂糖凝胶回收常见问题及解析

发布时间:2019-09-27 08:54 |  点击次数:


琼脂糖凝胶电泳因操作简单等诸多优点,广泛用于分子生物学实验,但 PCR 产物直接测序经常会出现套峰,导致这种结果的原因很多,比如:产物纯化不完全、碱基突变、非单一产物等。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收高质量 DNA 片段,无疑是避免测序套峰出现的重要环节之一。但是在使用琼脂糖凝胶回收试剂盒的实际操作过程中,可能由于操作者的失误,会导致 DNA 片段回收时回收率低、产物不纯有杂带等情况,从而影响下游实验。

实验原理流程图:




常见问题及解析

1DNA 片段回收率低

  1. 胶块溶解不完全,可适当延长水浴时间(控制在可控范围之内,一般 10 分钟之内)和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例;
  2. 胶块体积太大,应使用枪头捣碎,还不能充分溶解则先将其切为小块,分多次回收;
  3. 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖,乙醇挥发,影响回收效率;
  4. TAE 或 TBE 电泳缓冲液不新鲜,失去了缓冲能力,导致PH值升高,降低 DNA 和膜的吸附力,应及时更换电泳缓冲液,最好使用新鲜配制的电泳缓冲液,效果更好;
  5. 回收前的样品量太少,加大点样量;
  6. 洗脱前,预先 65℃ 预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率 30% 以上。
2、加入溶胶液温浴后,液体粘稠或后续步骤堵柱子
  1. 胶块溶解不充分,可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶;
  2. 胶块体积过大,应尽量切除多余部分,并将其切为小碎块,分几次回收;
  3. 水浴温度未达到试剂盒规定的稳定,水浴温度可用温度计进行测定;
3、琼脂糖凝胶块不溶
  1. 琼脂糖质量不好;
  2. 含目的片断的凝胶在空气中放置过久,使胶块失水干躁,建议切胶后立即进行回收,需要过夜保存的置于 -20
  3. 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
4、点样时 DNA 样品有漂出
  1. 柱子上的乙醇未完全挥发干净,延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。
从琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段是测序工作中重要的一个环节,常用的方法有电洗脱法、低熔点琼脂糖法、琼脂糖酶法等。为了缩短回收时长和提高回收效率,思科捷不断对产品进行优化升级。

思科捷提供的胶回收试剂盒 AE0101 使用优质溶胶液和硅胶柱纯化技术,纯化的DNA片段不抑制酶切、连接克隆等下游反应。在高离序盐存在的情况下,DNA片断选择性吸附于离心柱内的硅基质膜上,通过一系列快速漂洗、离心的步骤去除其他杂质,最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净 DNA 从硅基质膜上洗脱,整个实验操作只需 20min 即可完成。回收率高达 80% 左右,AE0101 产品性能展示:


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